High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAEC-PAD)
HPAEC-PAD
HPAEC-PAD = high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection
Mittels HPAEC-PAD können Kohlenhydrate getrennt werden, deren Glykan-Hydroxylgruppen bei hohem pH auf spezifische Weise mit der stationären Phase in der Säule in Wechselwirkung stehen.
Die Glykane verhalten sich als Anionen und die Wechselwirkung mit der Säule hängt von der Größe, Zusammensetzung und der Verknüpfung der Glykane ab. Die erhaltenen Daten geben Hinweise auf das Gesamtprofil der Glykosylierung eines Produkts oder an einer bestimmten Glykosylierungsstelle, was für den Vergleich von Chargen hilfreich ist.
Die Einzelkomponenten können im Vergleich mit gut charakterisierten Standards identifiziert werden (diese Standards sind nicht immer erhältlich und eine gemeinsame Elution von Bestandteilen kann nicht ausgeschlossen werden). Oder aber die Peaks der Zielsubstanzen werden aufgefangen und anschließend einer massenspektrometrischen Charakterisierung unterzogen. Das eigentliche Chromatogramm kann als „Fingerprint" des Glykosylierungsmusters des Glykoproteins verstanden werden. Dieses Profil kann dann nach Charakterisierung als Referenzstandard zu Vergleichszwecken bei der Chargenprüfung eingesetzt werden.
Diese Methode wird in der Kohlenhydrat-Analytik oft eingesetzt, um ein Labelling von Glykanen mit Fluoreszenz-Tags (z. B. 2-Aminobenzosäure oder 2-Aminoacridon) zu vermeiden.
Gründe:
-
Der erreichte Labelling-Grad für verschiedene Glykanstrukturen ist unterschiedlich. Die mit Labelling erhaltenen Ergebnisse sind deswegen unter Umständen in Richtung der erfolgreicher mit einem Label versehenen Strukturen verzerrt.
-
HPAEC-PAD liefert eine bessere Glykan-Auflösung.
