Liquid Chromatographic Patterns
HPLC-Profile werden für das Fingerprinting von Proteinen eingesetzt, das eindeutige, spezifische Muster erzeugt. Die Peptidfragmente eines Proteins werden mit Umkehrphasen-Flüssigchromatographie aufgetrennt und beim Verlassen der Säule wird die Absorption dieser Peptide bei einer bestimmten Wellenlänge im UV-Bereich gemessen. Dies ergibt ein zeitliches Muster von UV-Signalen: den Fingerprint. Die erzeugte Chromatogramme sind sehr gut reproduzierbar und können zur Untersuchung der Vergleichbarkeit von Proteinen verwendet werden, z. B. für den Vergleich von Proben- und Referenzchargen oder für die Charakterisierung von verschiedenen Referenzchargen.
RP-HPLC (reverse phase chromatography)
Zur Erstellung von RP-HPLC-Fingerprints (d. h. Chromatogrammen) müssen die Proteine zunächst mit einem geeigneten Enzym oder Reagenz verdaut werden. Anschließend werden die erzeugten Peptidfragmente an eine stationäre Phase gebunden und dann mithilfe eines organischen Lösungsmittelgradienten eluiert. Da alle Proteinbestandteile einer Probe gleichzeitig verdaut werden, kann der erzeugte Fingerprint auch zur Beurteilung der Reinheit, Heterogenität und Sequenzabnormalitäten der Probe verwendet werden. Dazu wird einfach die Gegenwart oder Abwesenheit von Peaks zu bestimmten Retentionszeiten geprüft.
Die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie ist eine der aufgelisteten geeigneten Methoden zur Erzeugung von chromatographischen Profilen und Daten über Identität, Homogenität und Reinheit von Proben.
SEC (size exclusion chromatography)
SEC ist eine Flüssigchromatographie-Methode, bei der die Teilchen aufgrund ihrer Größe bzw. genauer gesagt aufgrund ihres hydrodynamischen Volumens getrennt werden. Dabei wandern Teilchen verschiedener Größen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule und werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten eluiert. Die größten Teilchen verlassen die Säule zuerst. SEC ist besonders bei der Auftrennung von großen Molekülen nützlich, wie z. B. Proteinen und Polymeren.
Da die Auftrennung mit SEC aufgrund des hydrodynamischen Volumens statt des Molekulargewichts erfolgt, können Rückschlüsse auf die tertiäre Struktur eines Proteins gezogen werden. Mit SEC gelingt die Auftrennung von Proteinen der gleichen Sequenz und des gleichen Molekulargewichts, die sich aber unterschiedlich falten und sich daher hinsichtlich des hydrodynamischen Volumens unterscheiden.
SEC kann bei der Chargenfreigabe zu Vergleichszwecken verwendet werden. Es handelt sich um eine Methode, die in den Richtlinien ICH Q6B für die Beurteilung des Molekulargewichts und für die Erstellung von Flüssigchromatographie-Profilen empfohlen wird.
Ionenaustausch-Chromatographie (IC, auch IEX oder IEC)
Mit dieser Methode können Proteine (einschl. Antikörper), kleine Nukleotide und Aminosäuren aufgrund ihrer Nettoladung getrennt werden. Es wird dabei entweder eine Anionenaustauscher- oder eine Kationenaustauscher-Säule verwendet, mit der entweder positiv geladene oder negativ geladene Analytionen zurückgehalten werden. Da Proteine mit vielen funktionellen Gruppen gekennzeichnet sind, die positiv und/oder negativ geladen sind, eignet sich die Ionenaustauscher-Chromatographie auch besonders für die Reinigung und Auftrennung von Proteinen.
Ionenaustausch-Chromatographiege gehört auch zu den in den Richtlinien ICH Q6B empfohlenen Methoden für die Erstellung von Flüssigchromatographie-Profilen.
