N-terminale Sequenzierung
(aminoterminale Sequenzierung, Edman Abbau)
N-terminale (aminoterminale) Sequenzierung im Rahmen der Proteincharakterisierung erfolgt durch automatischen Edman-Abbau zur Bestimmung der aminoterminalen Aminosäuren des Peptids oder Proteins.
Die N-terminale Sequenzanalyse kommt in allen Phasen der pharmazeutischen Entwicklungspipeline zum Einsatz und dient außerdem in der Herstellungsphase zum Nachweis der Vergleichbarkeit und der beständigen Qualität von verschiedenen Chargen vor der Freigabe. Im Bereich Drug Discovery wird diese Methode auch zur De-novo Sequenzierung von neuen Proteinen eingesetzt und ist Bestandteil des Komplettangebots für die Charakterisierung von Proteinen.
Für die N-terminale Sequenzierung kommen gelöste Proben oder mit SDS-PAGE aufgetrennte Proteine infrage, die an PVDF-Trägermembrane gebunden werden (Western Blot). Diese Methode dient auch zur Analyse von möglichen Verkürzungen des Aminoterminus und zur Abschätzung des Anteils an N-terminalen Blockierungen, die gewöhnlich eine vollständige Sequenzierung verhindern. Die blockierende funktionelle Gruppe kann unter Umständen vor der Sequenzierung entfernt werden.
Im Rahmen des automatisierten Edman-Abbaus werden nach und nach die N-terminalen Aminosäuren des Proteins bzw. Peptids abgespalten. Die in einem Zyklus des Edman-Abbaus abgespaltenen Aminosäuren werden derivatisiert, mit RP-HPLC aufgetrennt und durch UV-Detektion nachgewiesen. Die Quantifizierung der Aminosäuren erfolgt durch den Vergleich mit einem Standard.
Die N-terminale Aminosäuren Analyse ist ein Schlüsselelement der ICH-Richtlinien Q6B für die Charakterisierung und Verifizierung von biopharmazeutischen Produkten im Rahmen der Zulassung.
